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登革病毒反向遺傳學技術構建與應用

時間:2020-04-01 來源:中國生物制品學雜志 作者:房恩岳,王玲,李玉華 本文字數:10850字

  摘    要: 登革病毒(dengue virus,DENV)是流行于世界范圍內的重要蟲媒病毒之一,近年來其傳播范圍的不斷擴大給疾病防控帶來了極大困難。反向遺傳學技術作為一種重要手段,廣泛應用于RNA病毒的相關研究,自1991年第1次成功構建DENV感染性克隆以來,明顯加速了DENV相關領域的研究。本文總結了DENV反向遺傳學技術的構建策略及技術突破,為DENV致病機制研究及疫苗研發提供新思路。

  關鍵詞: 登革病毒; 反向遺傳學; 感染性克隆; 嵌合疫苗;

  Abstract: Dengue virus is one of the most important arboviruses in the world. In recent years,the continuous expansion of its spread has brought great difficulties to disease prevention and control. As an important tool,reverse genetics technique has been widely used in RNA virus-related research. Since the first successful construction of dengue virus infectious clones in 1991,the research in dengue virus-related fields has been greatly accelerated. This article reviews the construction strategies and technological breakthroughs of dengue virus reverse genetics technique,and provides new ideas for the research on the pathogenic mechanism and vaccine of dengue virus.

  Keyword: Dengue virus; Reverse genetics; Infectious clone; Chimeric vaccine;

  登革病毒(dengue virus,DENV)是一類經蚊媒叮咬傳播并引起登革熱(dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF),甚至危及生命的登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)的蟲媒病毒。WHO報道,全球約一半人口存在DENV感染風險[1]。我國廣東省每年均呈現多地暴發,2005~2017年已報道4.5萬感染病例,2019年6月深圳市已有相關病例報道,嚴重威脅人類健康和公共衛生安全[2]。

  DENV屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),分為DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4四個血清型。病毒基因組為單股正鏈RNA,含有1個開放閱讀框,編碼產生3種結構蛋白(C、prM和E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。5′和3′末端各有一段非翻譯區(untranslated region,UTR),存在多種二級結構和保守序列,主要參與病毒RNA復制的調節。5′末端具有Ⅰ型甲基化帽結構(m7G5′ppp5′A),3′末端無多聚腺苷酸尾。

  反向遺傳學技術是直接從生物的遺傳物質入手來研究生物表型變化的一門技術。由COLTER等在1957年首次應用[3]。目前已通過該技術獲得多種正鏈RNA病毒的感染性克隆,為病毒感染機制等重要特性的研究開創了新的時代。1991年,LAI等[4]首次將反向遺傳學技術應用于DENV的研究并成功構建出第1個DENV-4型感染性克隆。隨后各實驗室陸續開始不同型別DENV感染性克隆的構建,并試圖從基因水平探索病毒毒力及感染機制等。然而,利用該技術獲得重組DENV仍存在諸多難點,尤其是DENV-3型,病毒序列在宿主細胞中的不穩定性和細菌毒性等常使病毒cDNA全長克隆發生隨機突變[5,6]。本文介紹了通過反向遺傳學技術研究DENV的主要流程及技術難點,并對反向遺傳學技術在DENV中的研究現狀作一綜述,旨在為DENV的致病機制研究及DF疫苗的研發提供參考。

  1 、DENV反向遺傳學技術的構建策略

  1.1、 DENV全長cDNA的構建

  為方便研究,人為地將反向遺傳學技術分為病毒全長cDNA的構建、感染性RNA的體外轉錄、轉染和恢復病毒的表型鑒定等步驟。在DENV的反向遺傳學研究中,獲得高保真的病毒全長cDNA是最關鍵的一步,直接影響恢復病毒的基因序列及表型。獲取病毒全長cDNA的方法主要有傳統的感染性克隆技術和長鏈PCR等新型技術。
 

登革病毒反向遺傳學技術構建與應用
 

  1.1.1 、感染性克隆技術

  感染性克隆技術是將病毒基因組cDNA克隆至相應克隆載體中,再通過體外轉錄RNA或直接轉染敏感細胞來獲得具有感染真核細胞能力的病毒,在DENV的反向遺傳學研究中應用最為廣泛。但此過程通常會在病毒基因組3′末端人為引入酶切位點,使獲得的病毒序列不能忠實于母本序列。研究者通常在cDNA 3′末端后添加丁型肝炎病毒核酶序列,核酶序列在細胞內完成自切割以去除額外引入的非病毒基因組序列[7]。此外,DENV cDNA全長約11 000 bp,而大多數質粒載體理論上僅可容納<10 000 bp片段,目的片段過長將限制質粒復制,或引起目的片段的堿基丟失或突變,影響片段的穩定性。對此,早期常采用構建亞克隆的方法,先將cDNA全長分解為不能編碼完整蛋白的短片段,分別構建至克隆載體中,再將各片段逐一拼接,最后連為全長cDNA克隆。有研究者將病毒cDNA全長分為2段并分別克隆至質粒載體中,再經雙酶切獲得2個cDNA線性片段,通過體外定向連接獲得線性cDNA全長[4,5]。雖然該方法可克服病毒cDNA全長克隆的不穩定性,但cDNA線性片段連接效率低,獲得的轉錄模板產量低,且操作耗時費力。目前主要嘗試多種不同克隆載體、宿主載體以獲得穩定的全長cDNA序列。

  1.1.1.1、克隆載體的選擇

  根據拷貝數不同,質粒分為高拷貝、中拷貝和低拷貝。為方便操作,提高效率,DNA克隆中會優先選擇高拷貝質粒。但DENV基因組中存在毒性序列、短串聯重復序列、原核啟動子元件等,會產生毒性蛋白,使用高拷貝質粒易引入堿基的插入、缺失或置換突變,且突變序列多為大腸埃希菌基因組的同源序列,即便能夠利用高拷貝質粒獲得感染性克隆,其生長速率也會非常慢,不利于后續操作[6,8]。大量研究報道,DENV cDNA全長克隆至低拷貝質粒中更穩定。GUALANO等[9]將DENV-2病毒cDNA分段克隆至低拷貝質粒pDVWS310中,成功轉錄出感染性病毒RNA。類似的方法也成功用于構建其他不同DENV-2毒株的感染性克隆[10,11]。盡管如此,某些DENV-3毒株仍無法用低拷貝質粒獲取穩定、完整的cDNA序列。細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)是能夠容納高達350 000 bp外源插入片段的環狀DNA分子,拷貝數極低,在一定程度上可降低DENV感染性克隆對宿主菌的毒性,代替質粒用于感染性克隆的構建。MOSIMANN等[12]通過將DNEV-3病毒基因組克隆至BAC中,成功獲得了病毒全長cDNA。有研究報道,通過該方法同樣可以獲得DENV-1和DENV-2病毒全長cDNA[13,14]。

  1.1.1.2、宿主載體的選擇

  原核和真核細胞中均有報道可成功獲取DENV感染性克隆。大腸埃希菌是最常用的原核細胞表達系統。有研究顯示,4種血清型相關株型DENV的感染性克隆均能夠在不同基因型大腸埃希菌中穩定傳代復制[4,15,16]。真核細胞通常比細菌更耐受DENV的毒性序列,對于無法在大腸埃希菌中穩定復制的DENV已被成功克隆至真核系統中,其中釀酒酵母應用最廣。在酵母中構建感染性克隆的兩種常用策略分別為酵母人工染色體(yeast artificial chromosome,YAC)和酵母-大腸埃希菌穿梭載體,其中穿梭載體方法較YAC方法更簡單、可靠,可直接在酵母細胞內通過同源重組連接病毒cDNA全長。POLO等[10]通過穿梭載體的方法在酵母中構建了DENV-2全長cDNA。隨后有報道用該方法獲得了DENV-3、DENV-1和DENV-4全長cDNA[17,18,19]。

  1.1.2 、新型反向遺傳學技術

  感染性克隆的應用解決了大部分DENV的cDNA制備,但有些DENV仍無法獲取穩定、高保真的cDNA序列。隨著分子生物學技術的不斷進步,不依賴于載體、宿主菌的病毒全長cDNA獲取方式不斷被發現,如長鏈PCR技術、無縫連接技術等,為DENV反向遺傳學研究提供了新的技術方法。

  隨著多種聚合酶保真度的提高和反應條件的優化,長鏈PCR技術和無縫連接技術等廣泛應用于DENV全長cDNA制備,極大地縮短了時間,提高了實驗效率。GRITSUN等[20]通過長鏈RT-PCR直接擴增病毒全長cDNA,此外,又通過將2個具有同源臂的擴增片段進行融合PCR獲得病毒全長cDNA;GOVINDARAJAN等[21]也利用長鏈PCR技術成功構建了多株黃熱登革嵌合病毒(chimeric yellow fever dengue,CYD)。SIRIDECHADILOK等[22]利用Gibson無縫連接技術高效快速地完成了多個DENV重疊PCR片段的正確連接,并利用引物末端人工加入的真核啟動子CMV,直接將連接產物轉染細胞獲得DENV恢復病毒。此外,AUBRY等[23]開發了感染性亞基因組擴增子技術(infectious-subgenomic-amplicons,ISA),用已有病毒基因庫為模板,將病毒全長cDNA分為3段進行擴增,每個片段含有70~100 bp的重疊區域,并且第1個和最后1個片段分別在5′和3′末端添加CMV啟動子和丁型肝炎核酶序列,再將PCR產物混合后直接轉染敏感細胞,從而收獲感染性病毒,該方法已成功用于DENV的拯救。

  1.2、 感染性RNA的體外轉錄和轉染

  感染性RNA的體外轉錄技術發展已經比較成熟,Promega、Roche等公司均有商業化試劑盒上市。需要注意的是,天然DENV基因組5′末端存在Cap結構,該結構既增加了病毒的感染能力,又提高了RNA末端的穩定性。但體外轉錄獲得的RNA其5′末端無Cap結構。因此,在轉錄體系中需人工加入m7G Cap Analog,利用模板cDNA 5′末端的噬菌體啟動子SP6或T7,體外轉錄產生加帽的正鏈RNA病毒。

  感染性RNA進入宿主細胞的方式及轉染細胞的選擇是反向遺傳的又一個關鍵步驟,直接影響恢復病毒的拯救。最早有研究者將DENV的RNA轉錄產物直接注射至動物體內以產生恢復病毒,但由于動物實驗不可控因素較多,轉染病毒敏感細胞仍是目前常用方法。常用的轉染方法包括脂質體法和電穿孔法,錢鋒等[24]研究發現,兩種方法的轉染效率無明顯差異,雖然脂質體轉染操作更方便,但電穿孔法使用的細胞范圍更廣、轉染時間更快、無潛在的細胞毒性,在使用中可通過優化電擊參數及電轉緩沖液最大限度地提高轉染效率。多位學者均通過電轉染的方式成功獲得了多種型別的重組DENV[25,26,27]。對于轉染細胞的選擇,病毒的敏感性、恢復病毒的拯救效率及后期應用等均是需要考慮的因素。BHK-21、C6/36、LLC-MK2和Vero細胞等均為DENV RNA轉染常用細胞。DE BORBA等[28]和CHEN等[29]通過轉染C6/36細胞,相繼成功獲得DENV-1恢復病毒和DENV-4/3嵌合病毒。YANG等[30]通過轉染PHK細胞,成功制備了JEV/DENV-1嵌合病毒。ZHU等[11]及SANTOS等[17]以BHK-21為轉染細胞獲得了DENV-3和DENV-2恢復病毒。由于BHK-21細胞是無限傳代細胞,具有潛在致瘤性,僅供科研使用。Vero細胞作為WHO和《中國生物制品規程》認可并推薦用于疫苗生產的細胞系,具有可連續傳代、遺傳穩定、生長快、對DENV敏感且病毒增殖滴度高等優點,賽諾菲巴斯德、日本武田制藥等機構已通過電轉染的方式將其用于登革嵌合疫苗的反向遺傳學研究中[31,32]。

  1.3 、恢復病毒的表型鑒定

  表型鑒定是驗證恢復病毒與母本病毒是否具有相似生物學特性的重要手段。病毒表型主要由共有序列和突變譜共同決定。突變譜是指RNA病毒的“異質性”,即由于真核細胞體內的RNA聚合酶缺乏核酸酶活性,導致病毒RNA復制過程中出現錯配而產生混合病毒群體。反向遺傳學方法獲得的恢復病毒僅保留了母本病毒中的共有序列,不能保留原始病毒樣品中已存在的突變譜。此外,利用SP6/T7進行體外轉錄的過程中,易引入不同于原突變譜的隨機突變,可能改變恢復病毒的表型[33]。因此,感染性RNA及恢復病毒的表型鑒定對DENV反向遺傳學平臺的穩定性評價具有重要意義。通常是將感染性RNA轉染細胞后,觀察細胞病變、蝕斑大小或通過免疫熒光技術檢測DENV蛋白表達等鑒定恢復病毒是否與母本病毒具有相同表型。實驗中可將DNA酶和RNA酶處理后的轉錄產物作為對照,以驗證用于轉染的RNA來源并忠實于模板序列。此外,還可在cDNA模板中人為引入遺傳標記。恢復病毒的生長動力學特征、宿主范圍以及在動物模型中的毒力研究、免疫原性研究等,均應與母本病毒的表型相比較來進行鑒定。

  2 、DENV反向遺傳學技術的應用

  自反向遺傳學技術成功用于DENV拯救后,DENV在不同領域的研究均取得了迅速發展。目前可通過對DENV進行定點突變、缺失、插入或重排等,以研究其致病基因、病毒復制、基因功能、宿主與病原體間的相互作用、疫苗及抗病毒藥物的研發等。

  2.1、 反向遺傳學技術與DENV致病機制

  DENV非結構蛋白主要參與病毒RNA的復制及組裝。近年來,有研究報道NS1、NS4B和NS5相關基因的改變均可引起DENV致病性的改變。CRABTREE等[34]構建了DENV-2的全長感染性克隆,并通過定點突變發現糖基化位點NS1-130N和NS1-207N分別缺失或聯合缺失均可降低DENV在C6/36細胞中的復制能力,同時也顯著降低對小鼠的神經毒力,提示DENV-2 NS1蛋白上的糖基化可能會影響病毒的致病性。GRANT等[35]制備了DENV-2強毒株D2Y98P-PP1的感染性克隆,引入NS4B(F52L)的單個氨基酸突變后發現病毒的RNA合成顯著降低,并且完全喪失了對AG129小鼠的致病力。隨后對DENV-2弱毒株TSV01的NS4B相同位點進行了反向突變后,毒力明顯增強,提示NS4B的第52位氨基酸是DENV-2的關鍵毒力位點。HANLEY等[36]將DENV-4 814669株NS5基因中連續的80個帶電荷氨基酸分別突變為不帶電荷的丙氨酸,構建出32個重組突變病毒中,有19個突變病毒在乳鼠腦內復制能力增強,3個突變病毒可顯著抑制其在乳鼠腦內的復制能力,這對重組減毒活疫苗的研發有重要意義。

  E蛋白是DENV最大的結構蛋白和主要的包膜蛋白,在病毒侵染細胞過程中發揮重要作用。BUTRAPET等[37]構建了DENV-2 16681株的多個點突變感染性克隆質粒,通過體外轉錄、電轉染Vero和C6/36細胞,成功獲得突變病毒,并發現DENV-2的E蛋白鉸鏈區內的E52、E54、E133位氨基酸突變后會影響病毒與宿主細胞的融合能力,從而降低病毒的感染性。DE WISPELAERE等[38]通過PCR擴增和酵母重組的方法獲得了DENV-2 NGC突變株病毒,發現E蛋白結構域Ⅰ/結構域Ⅲ接頭處的E-G296A、E-S298A、E-Y299F 3個保守氨基酸的突變可顯著抑制病毒的裝配。

  病毒UTR內含有多種保守的RNA二級結構,主要指導病毒的復制。LEARDKAMOLKARN等[39]在DENV-2 16681感染性克隆的基礎上,通過PCR技術在5′UTR的第14、15、57位核苷酸處引入定點突變,發現這3個位點的改變會降低病毒復制能力,減弱病毒對乳鼠的神經毒力。此外,有報道顯示,不同型別DENV的3′UTR和5′UTR中引入缺失突變后,均可導致病毒毒力減弱[40,41]。這些通過反向遺傳學技術將突變引入DENV全長cDNA中,觀察毒力改變,從而鑒定DENV關鍵毒力位點,為解釋DENV復制機制、減毒機理及其相關功能的研究奠定了理論依據。

  2.2、 反向遺傳學技術與DENV嵌合疫苗

  疫苗接種是預防DF最經濟有效的手段,反向遺傳學技術為DF疫苗的研制開辟了新途徑。四價嵌合疫苗目前是臨床試驗中應用最多的DF疫苗,也是最有前景的疫苗之一。該類疫苗以減毒株作為骨架病毒,通過將其結構蛋白prM-E基因替換為目的基因獲得表達目的基因結構蛋白的嵌合體病毒。其中巴斯德公司研發的CYD-TDV是全球唯一批準上市的DF疫苗,也是第一款獲得美國FDA批準的DF疫苗。美國NIH研發的LATV△30和日本武田公司研發的DENV ax均處于臨床試驗階段。

  CYD-TDV疫苗是以世界公認安全的黃熱疫苗株YF17D為骨架,通過反向遺傳學技術將DENV-1、2、3、4型的prM-E基因替換掉YF17D的相應結構蛋白基因研制而成。臨床前及臨床Ⅱ期試驗結果表明,該疫苗遺傳穩定,且耐受性和安全性較好[42]。但在臨床Ⅱb及臨床Ⅲ期試驗中發現,不同個體對4種血清型的DENV表現出不均衡的保護反應,對Ⅲ型和Ⅳ型DENV的保護率為75%,Ⅰ型為50%,但對Ⅱ型病毒效用僅為35%[43]。美國NIH研發的四價登革嵌合疫苗LATV△30(TV003/TV005),其中rDENV1Δ30、rDENV3Δ30和rDENV4Δ30是通過反向遺傳學技術刪除了DENV-1、3、4型3′末端非編碼區中的30個核苷酸以達到減毒目的,rDENV2則是以rDENV4Δ30為骨架將其prM-E基因替換為DENV-2 NGC株相應基因而達到減毒目的。目前已進入Ⅲ期臨床試驗階段,僅1次免疫后即可在受試者體內檢測到較高的四型血清陽轉率,高達74%~92%(TV003)和90%(TV005)[44]。日本武田制藥公司研發的DENV ax,是以DENV-2型減毒株PDK53為骨架,分別將1、3、4型DENV減毒株的prM-E基因進行嵌合替換研制而成,也已進入Ⅲ期臨床試驗,表現出良好的安全性和免疫效果[45]。此外,有文獻報道,DENV骨架病毒的非結構蛋白能誘導機體產生CD8+T細胞,可針對其他型別DENV發揮細胞免疫應答[46]。

  3、 結語

  隨著世界人口流動性的增大,DENV傳播區域不斷擴增,加劇了病毒對全球人類健康的危害。尤其近年來我國廣東、云南等地DF疫情的頻繁爆發更是令人擔憂。反向遺傳學技術的出現對研究DENV的致病機制、疫苗開發提供了強有力的手段。感染性克隆的產生是反向遺傳學技術發展的關鍵一步,多年來不同型別DENV感染性克隆的成功構建為DENV的深入研究積累了大量技術儲備。并且,隨著基因合成的普及、新型DNA連接技術和高保真PCR擴增技術的發展,許多新型方法不斷引入至反向遺傳學技術中,為其提供了更容易、更快速、更可靠的方法來揭示DENV研究中的科學問題。然而反向遺傳學技術也存在一定的安全風險,多種新型登革嵌合病毒的出現,如YFV/DENV、TBEV/DENV、JEV/DENV等,可能帶來潛在的生物安全風險,科研工作者應合理利用反向遺傳學技術,在技術可控的范圍內推動科學技術的進步。

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