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脊灰病毒空心顆粒、實心顆粒的分離技術探究

時間:2020-04-01 來源:中國生物制品學雜志 作者:曾智坤,喻剛,王繼麟, 本文字數:5391字

  摘    要: 目的 比較3種不同密度梯度離心方法對脊髓灰質炎病毒空心顆粒、實心顆粒的分離效果。方法 選擇蔗糖密度梯度離心、氯化銫密度梯度離心、Optiprep(碘克沙醇溶液)密度梯度離心方法,對脊髓灰質炎病毒進行純化,抽取離心之后的蛋白條帶,通過計算蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒顆粒透射電鏡觀察,評價其對病毒空心顆粒、實心顆粒的分離效果。結果 病毒液經蔗糖、氯化銫和Optiprep 3種介質超速離心,均能分離空心顆粒和實心顆粒。氯化銫密度梯度離心法蛋白回收率優于Optiprep及蔗糖密度梯度離心法;Optiprep密度梯度離心法蛋白純度優于氯化銫及蔗糖密度梯度離心法。結論 通過蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒顆粒透射電鏡觀察初步評價了3種方法對脊髓灰質炎病毒空心顆粒和實心顆粒的分離效果,為脊髓灰質炎病毒分離純化提供了參考。

  關鍵詞: 氯化銫; 蔗糖; 碘克沙醇; 密度梯度離心; 空心顆粒; 實心顆粒; 純化;

  Abstract: Objective To compare the separation effects of empty and solid viral particles of poliovirus by sucrose density gradient centrifugation,cesium chloride density gradient centrifugation and Optiprep density gradient centrifugation.Methods Poliovirus was purified by three kinds of density gradient centrifugation methods respectively,and the protein bands were extracted. The separation effects of empty and solid viral particles were evaluated by protein recovery rate,SDS-PAGE and transmission electron microscopy. Results Both empty and solid viral particles were separated by ultracentrifugation in three media. The protein recovery rate of cesium chloride centrifugation was higher than those of Optiprep and sucrose density gradient centrifugation. However,the purity of protein purified by Optiprep centrifugation was higher than those by cesium chloride and sucrose density gradient centrifugations. Conclusion The separation effects of empty and solid viral particles by three density gradient centrifugations were preliminarily evaluated,which provided a reference for the separation and purification of poliovirus.

  Keyword: Cesium chloride; Sucrose; Optipprep; Density gradient centrifugation; Empty particles; Solid particles; Purification;

  在病毒研究過程中,病毒純化方法一直是研究過程的難點,最常用的方法一般為密度梯度離心法[1,2]。區帶離心又分為差速區帶離心和平衡區帶離心。兩種區帶離心法均需先在離心管中用某種低分子溶質(如蔗糖溶液)調配好密度梯度,在密度梯度之上加入待處理的料液后進行離心操作。區帶離心是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下將顆粒分配至梯度中某些特定位置上,形成不同區帶的分離方法。該方法優點為:(1)分離效果好,可一次獲得較純顆粒;(2)適應范圍廣,可同差速離心法一樣分離沉降系數差的顆粒,又可分離具有一定浮力密度差的顆粒;(3)顆粒不會擠壓變形,能保持顆粒活性,并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。其最常用的介質為氯化銫、蔗糖和多聚糖,在流感病毒、狂犬病病毒、脊髓灰質炎(簡稱脊灰)病毒以及EV71等腸道病毒的分離中應用比較廣泛[3,4,5,6,7,8]。但也有文獻報道,使用Optiprep(碘克沙醇溶液)分離效果好[9]。

  脊灰病毒屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬[10]。病毒顆粒核衣殼為立體對稱的二十面體,無包膜,有60個殼微粒,病毒中心由單股RNA組成,外圍由60個殼粒拷貝組成,殼粒中含4種結構蛋白,分別為VP1、VP3和由VP0分裂而成的VP2和VP4。VP1為主要的外露蛋白,至少含2個表位,可誘導中和抗體產生[11]。因此,蛋白進行電泳時,實心顆粒會出現VP1、VP2、VP3、VP4這4種結構蛋白,但VP4一般含量較少,不易出現。而空心顆粒會出現VP0、VP1、VP3這3種結構蛋白[12]。
 

脊灰病毒空心顆粒、實心顆粒的分離技術探究
 

  因此,脊灰疫苗在生產過程中進行質量控制的關鍵是進行D抗原(實心顆粒)含量的檢測[13]。目前國內外絕大部分生產商采用ELISA法檢測脊灰D抗原[14]。一般是基于單抗、多抗的單用或兩者的聯用。理想的檢測抗體應該是能夠特異性識別脊灰D抗原而不識別C抗原(空心顆粒)的抗體。因此,在篩選過程中必須使用盡可能純化的D抗原及C抗原。

  基于此,本研究初步比較了蔗糖密度梯度離心、氯化銫密度梯度離心、Optiprep密度梯度離心3種方法對脊灰病毒空心顆粒、實心顆粒的分離效果。

  1 、材料與方法

  1.1、 病毒

  脊灰Sabin株Ⅰ型病毒原液(蛋白含量為4.52 mg/mL)由武漢生物制品研究所有限責任公司腸道疫苗室提供。

  1.2 、主要試劑及儀器

  Optiprep(60%)購自美國Sigma公司;蔗糖購自國藥集團化學試劑有限公司;氯化銫購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Pierce BCA定量分析試劑盒、蛋白質marker購自美國Thermo Fisher公司;蛋白電泳儀購自美國BioRad公司;超離管購自美國Beckman公司;超濾離心管購自美國Millipore公司。

  1.3、 氯化銫密度梯度離心

  配制密度為1.34 g/cm3的氯化銫溶液,將其中1份用PBS定容至13.5 mL,另外1份加入已超濾濃縮的病毒液3.5 mL(總蛋白含量為15.82 mg),PBS定容至13.5 mL,加至超離管中,熱封,4℃,680 000×g離心18 h;暗室抽取蛋白條帶,加至超濾離心管中,加入PBS至超濾管管口處,4℃,3 000×g離心10 min;待超濾管中液體減少至1.5 mL后,重復該過程5次,最后1次離心結束后,收集超濾離心管中的溶液。

  1.4 、蔗糖密度梯度離心

  配制成梯度為15%、25%、35%、45%、55%的蔗糖溶液,依次從低濃度到高濃度鋪蔗糖密度梯度。在頂端液面上加入3.5 mL濃縮病毒液(總蛋白含量為15.82 mg),480 000×g離心3.5 h;暗室抽取蛋白條帶,加至超濾離心管中,PBS稀釋,4℃,3 000×g離心10 min;重復該過程5次,最后1次離心結束后,收集超濾離心管中的溶液。

  1.5 、Optiprep密度梯度離心

  從低到高配制成梯度為15%、25%、35%、45%、55%的Optiprep溶液。在頂端液面上加入3.5 mL濃縮病毒液(總蛋白含量為15.82 mg),4℃,480 000×g離心3.5 h;暗室抽取蛋白條帶,加至超濾離心管中,PBS稀釋,4℃,3 000×g離心10 min;重復該過程5次,最后1次離心結束后,收集超濾離心管中的溶液。

  1.6 、蛋白含量檢測

  采用BCA法。標準品蛋白濃度設為1、2.5、5、10、20、40、200μg/mL,繪制標準曲線。具體操作按Pierce BCA定量分析試劑盒說明書進行。

  1.7、 純度分析

  采用12%SDS-PAGE分析。加入4×SDS還原型上樣緩沖液,混勻,100℃煮10 min;上樣,非預染蛋白質marker 10μL/孔,樣品20μL/孔,120 V恒壓電泳;恒溫染色3 h;脫色至背景干凈。利用Quantity One軟件分析結果。

  1.8、 病毒顆粒的透射電鏡觀察

  將樣品稀釋至10~20μg/mL,取1滴于薄膜手套上,將銅網正面置于其中5 min;取出銅網,待自然干燥后,將銅網正面置于磷鉬酸液滴中5 min;取出銅網,自然晾干,送中國科學院武漢病毒研究所進行透射電鏡分析。

  2 、結果

  2.1 、超速離心分離條帶的觀察

  結果顯示,病毒液經3種介質超速離心分離條帶后,離心管里均可見3條條帶,其中氯化銫和Optiprep的條帶較濃,蔗糖的條帶稍微彌散,見圖1。

  2.2 、3種方法純化后的蛋白回收率

  獲得的標準曲線方程為y=0.012 4 x-0.010 8,蛋白濃度與對應的A562具有良好的線性關系,R2=0.999 7,見圖2。氯化銫、Optiprep及蔗糖密度梯度離心法蛋白回收率分別為79.9%、62.5%和52.3%,見表1。

  2.3 、3種方法純化后的蛋白純度

  12%SDS-PAGE分析顯示,Optiprep、氯化銫及蔗糖密度梯度離心法純化后的蛋白純度分別為97.27%、95.75%和93.27%,見圖3。

  圖1 病毒液經3種介質超速離心分離條帶
圖1 病毒液經3種介質超速離心分離條帶

  Fig 1.Separation of poliovirus particles by ultracentrifu-gation in three media

  A:蔗糖;B:氯化銫;C:Optiprep。

  圖2 BCA法檢測蛋白含量標準曲線
圖2 BCA法檢測蛋白含量標準曲線

  Fig 2.Standard curve for determination of protein content by BCA

  表1 病毒液經3種方法純化后蛋白含量及回收率的比較
 表1 病毒液經3種方法純化后蛋白含量及回收率的比較 

  2.4 、病毒液的透射電鏡觀察

  選擇Optiprep密度梯度離心法分離的上、中、下層病毒液進行透射電鏡觀察,結果顯示,上層、中層為不完整的病毒顆粒,即空心顆粒,下層為完整的病毒顆粒,即實心顆粒,且病毒顆粒純度較高,見圖4。

  圖3 3種介質純化后蛋白的SDS-PAGE分析
圖3 3種介質純化后蛋白的SDS-PAGE分析

  Fig 3.SDS-PAGE profile of protein purified by ultracentri-fugation in three media

  M:預染低分子量蛋白質marker;1~3:依次為氯化銫分離后的上、中、下三層條帶;4~6:依次為Optiprep分離后的上、中、下三層條帶;7~9:依次為蔗糖分離后的上、中、下三層條帶。

  圖4 Optipre分離后的空心顆粒(A)及實心顆粒(B)的透射電鏡觀察
圖4 Optipre分離后的空心顆粒(A)及實心顆粒(B)的透射電鏡觀察

  Fig 4.Electron microscopy of empty(A)and solid(B)viral particles after Optipre density gradient centrifugation

  3、 討論

  本實驗目的在于分離出純度盡可能高的空心病毒顆粒,作為篩選抗脊灰I型病毒D抗原單克隆抗體中的實驗材料。基于此,在動物免疫過程中需要大量的免疫原時,后續試驗可選用氯化銫作為密度梯度離心的介質;而對于單克隆抗體篩選用的抗原時,則選用Optiprep作為密度梯度離心的介質。

  密度梯度離心方法中,目前最常用的介質仍然是氯化銫、蔗糖等。這兩種介質在病毒純化過程中能滿足絕大多數的需求。但根據純化病毒的目的不同,應選擇不同的介質。如果想獲得大量的分離后的病毒顆粒時,最好選用氯化銫密度梯度離心法進行分離純化,該方法能保證病毒蛋白的回收率;如果想盡可能分離出純度更高的空心顆粒及實心顆粒時,最好選用Optiprep密度梯度離心法;如果對這兩點要求均不高,則可以選擇蔗糖密度梯度離心法,因蔗糖成本低,易獲取。總之,這3種方法各有各的優點,可以根據目的不同選擇不同的介質。

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