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模擬微重力效應對果蠅睡眠的作用研究

時間:2020-04-01 來源:生物化學與生物物理進展 作者:張虹影,李志輝,章路, 本文字數:16187字

  摘    要: 本研究旨在探討利用模擬微重力效應研究微重力對果蠅運動及睡眠影響的可行性.通過研制能夠在模擬微重力環境下實時監測果蠅行為的隨機定位儀,監測短時間(3 d)模擬微重力處理過程中,及長時間(10 d、20 d、30 d)處理后雄蠅運動和睡眠的變化;選取受影響較顯著的短時間處理組,研究模擬微重力效應對生物鐘核心基因(period (per)、timeless(tim)、clock (clk)、cycle (cyc)、cryptochrome (cry))、神經遞質多巴胺(dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)關鍵合成酶(多巴脫羧酶、酪氨酸羥化酶、色氨酸羥化酶)的編碼基因ddc、pale和trh表達水平及DA和5-HT含量的影響.結果顯示:短時間暴露下,雄蠅夜晚的運動量增加、單位時間運動次數增加、睡眠時間和次數減少、生物鐘基因tim、clk、cyc、cry及神經遞質合成相關編碼基因ddc、pale和trh的表達水平均顯著上升;長時間處理后對雄蠅運動和睡眠的影響較小.本研究認為利用模擬微重力效應研究微重力對果蠅運動及睡眠的影響是可行的,相關研究結果對航天醫學研究具有借鑒意義.

  關鍵詞: 模擬微重力; 隨機定位儀; 果蠅; 運動; 睡眠;

  Abstract: This study was aimed to investigate the feasibility of using simulated microgravity to study the effects of microgravity on activity and sleep of Drosophila melanogaster. Simulated microgravity experiments performed using the random positioning machine(RPM) and male Drosophila melanogaster, and the activity and sleep of the flies were monitored using the DAM system(Trikinetics, USA). First, flies were exposed to simulated microgravity for a short time(3 days) with DAM system monitoring. Next, after being exposed to simulated microgravity for a long time(10, 20, and 30 days), flies were removed to be monitored for 3 consecutive days under control conditions. Then, the flies after short-term treatment(3 days) with greater impact were sampled to study the effects of simulated microgravity on the major circadian clock genes period(per), timeless(tim), clock(clk), cycle(cyc), cryptochrome(cry), and ddc, pale, trh genes encoding dopa decarboxylase, tyrosine hydroxylase, tryptophan hydroxylase, that involved in synthesis of neurotransmitter dopamine(DA) and 5-hydroxy-tryptamine(5-HT), and the contents of DA and 5-HT. The results showed that during short-term treatment, total activity accounts and activity accounts in wake period both increased, and total sleep and number of sleep episode both decreased at night; after short-term treatment, the relative expression levels of tim, clk, cyc and cry increased, and the relative expression levels of ddc, pale and trh increased; after long-term treatment,overall effect on activity and sleep was slight. This study suggests that it is feasible to study the effects of microgravity on activity and sleep of Drosophila melanogaster by simulated microgravity, and valuable reference can be provided for aerospace medical research.

  Keyword: imulated microgravity; random positioning machine; Drosophila melanogaster; activity; sleep;

  隨著中國載人航天事業的不斷發展,未來中國空間站的建成并投入使用,將有更多的航天員或航天工程師被送入太空,并長期在軌工作.相關研究表明,航天員在軌期間普遍存在睡眠時間短、睡眠質量差等睡眠問題.良好的睡眠對人體健康的重要性不言而喻[1,2,3],如何保障航天員的在軌高質量睡眠成為亟待解決的重要科學問題.空間環境下微重力、光、噪聲、晝夜節律及作息制度[4,5]等被認為是造成航天員睡眠障礙的主要誘因,為此科學家們從航天器的設計、配置及睡眠環境的設置到航天員的訓練都開展了大量的工作.但實際調查結果顯示,這些并不能完全解決航天員的在軌睡眠問題[4,5,6,7,8].這與我們目前對空間環境,特別是微重力對睡眠的影響及作用機制的了解較少,無法針對性地對航天員進行訓練、調整及實現生物節律干預等密切相關.

  目前,微重力對睡眠的影響研究主要基于天基實驗和地基模擬實驗,前者主要來自國外航天員的飛行報告及相關在軌監測結果,而國內的研究工作鮮見報道.根據來自美國國家航天與航空局的多批次航天員的自我報告或活動記錄儀監測結果顯示,許多航天員在太空中,睡眠時間明顯減少,甚至不足6 h,且每個夜晚的波動較大,同時睡眠結構也發生了改變,睡眠質量變差,并且航天員還普遍存在促睡眠用藥的記錄.雖然服用后主觀入睡時間縮短且睡眠質量提高,但體動記錄儀顯示睡眠效率并沒有提高,睡眠時長也并沒有增加,而且此類藥物的副作用也非常值得警惕[4,9,10].
 

模擬微重力效應對果蠅睡眠的作用研究
 

  鑒于航天飛行任務的特殊性和航天搭載空間資源的稀缺性,利用航天員或實驗動物開展在軌研究都存在較大的困難,難以進行較為系統深入的作用機制研究.模擬微重力效應的地基實驗成為重要的輔助研究手段,如頭低位臥床法[11,12]、尾懸吊[13]或后肢卸載[14]法、隨機定位儀[15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28]等.其中,隨機定位儀憑借其易于操作、可連續工作、性能穩定可靠、可在短期內進行多次重復等優勢,運用越來越廣泛.但目前地基模擬實驗研究中缺乏關于模擬微重力效應對睡眠影響的相關報道,其重要原因之一是缺乏相應的研究設備、研究模型和評價方法.

  果蠅憑借體積小、繁殖快及成熟期短等特點和優勢成為了航天搭載的“常客”,多項研究表明果蠅對空間環境較為敏感,航天飛行會令其產生一定的生理和遺傳反應[27,28,29,30,31,32];雖然地基的實驗結果表明,果蠅能夠對隨機定位儀模擬的微重力效應做出響應[19,20],經隨機定位儀暴露的果蠅能夠發生部分與真實的微重力相似的基因表達[27,28].但利用隨機定位儀研究果蠅行為,特別是睡眠行為變化的研究幾乎未見報道.近年來,果蠅作為研究睡眠行為的模式生物被廣泛應用[33,34,35,36,37,38],本研究研制一套適用于果蠅睡眠研究的隨機定位儀,并從果蠅活動規律和生物鐘調控機制的變化兩方面出發,一方面探討利用隨機定位儀研究果蠅睡眠行為的可行性,另一方面,初步探索模擬微重力效應對果蠅睡眠的影響及作用機制,從而為研究微重力效應對生物體睡眠的影響提供新的思路.

  1、 材料與方法

  1.1 、果蠅培養

  野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)Canton-S(CS)品系,購自中國科學院上海生命科學研究院生化細胞所果蠅資源與技術平臺.果蠅培養采用玉米粉-糖-酵母,培養于人工氣候箱中,光照周期12 L∶12 D(6∶00 am開燈,6∶00 pm關燈),溫度(25±1)℃,相對濕度(60±2)%.本研究所用果蠅均為CS雄性果蠅.

  1.2 、微重力效應模擬系統

  本研究所用的微重力效應模擬系統由中國科學院城市環境研究所和上海技術物理研究所針對果蠅的特點聯合研制,主要由隨機定位儀(圖1a)及系統控制(圖1b、c)兩部分組成.隨機定位儀主要由機座、垂直支撐架、外轉動機構、內轉動機構、驅動系統、樣品安裝單元和光源組成.其中樣品安裝單元針對果蠅行為監測設備DAM2監測器和DPM監測器(TriKinetics,美國)的特點,設計有相應的樣品臺,相關電源和信號傳輸采用定制導電傳輸組件設計,能夠避免導線在旋轉過程中造成扭傷,保證設備穩定工作同時,實現監測數據的實時傳輸.光源由LED燈條組成,可以對光照時間及強度進行穩定精確的控制.系統控制由電控箱(圖1b)和控制軟件(圖1c)組成,控制微重力模擬單元伺服電機及照明系統,同時根據果蠅的特點及相關文獻報道,設計適于果蠅研究的回轉參數,模擬結果顯示微重力模擬效果大約為10-4g.

  Fig.1 Microgravity simulation system
Fig.1 Microgravity simulation system

  (a)Random positioning machine.(b)Electric cabinet.(c)Control software.

  1.3、 運動及睡眠行為監測

  1.3.1 、短時間模擬微重力效應

  將新生雄蠅裝入果蠅行為監測系統DAM2監測器(美國TriKinetics)中,具體操作如下:在監測玻璃管(內徑為3.5 mm,長度為65 mm)一側裝入培養基(5%蔗糖+2%瓊脂)供雄蠅食用;另一側利用棉花塞住管口,每只玻璃管裝入一只雄蠅,每個監測器放32根監測管,每5 min記錄一次雄蠅的運動情況.設置處理組(G組)以及對照組(C組),將G組的監測器放置于隨機定位儀中,靜置至少24 h以上使雄蠅適應,于第3天6∶00 am開啟設備連續處理3 d,之后關閉設備,擺正監測器繼續監測24 h用以觀察雄蠅的恢復情況;C組的監測器放置于隨機定位儀旁,確保兩組所處的光照、溫度、濕度等環境相同.

  1.3.2 、長時間模擬微重力效應

  在短時間模擬微重力效應對雄蠅運動及睡眠的影響研究中,設備關閉后雄蠅的運動和睡眠行為很快恢復至對照狀態(詳見2.1.1).因此,開展了較長時間的處理,具體如下:將新生雄蠅裝入試管中,設置處理組(G組)以及對照組(C組),將G組的試管放置于隨機定位儀中,靜置至少24 h以上使雄蠅適應其環境,之后開啟設備連續處理,C組的試管放置于隨機定位儀旁.期間G組與C組均每3 d更換新鮮的培養基.于處理的第10、20、30 d分別從C組和G組隨機取出部分雄蠅,在對照條件下用DAM2對兩組雄蠅的行為進行監測,具體操作方法參照1.3.1,統計分析3 d內雄蠅的運動和睡眠情況.

  以上實驗中,雄蠅的運動和睡眠情況統計均來自各組每只雄蠅的均值.考慮到CS果蠅睡眠晝夜間的差異,對白天、夜晚及一個晝夜周期(24 h)的數據分別進行統計,運動能力主要通過統計目標時間段內的總運動量和單位時間運動量(總運動量/清醒的時間)進行評價,睡眠情況主要通過統計目標時間段內的睡眠時間、睡眠次數及每次睡眠時長(睡眠時間/睡眠次數)進行評價,果蠅靜止不動的時間大于5 min時,判斷果蠅處于睡眠狀態[31].

  1.4 、生物鐘相關基因表達水平的檢測

  針對對模擬微重力效應有顯著響應的短時間處理組,本研究利用熒光定量PCR進一步檢測模擬微重力效應對period(per)、timeless(tim)、clock(clk)、cycle(cyc)和cryptochrome(cry)五個核心生物鐘相關基因表達的影響,具體方法如下:取新生雄蠅裝入試管中,設置處理組(G組)以及對照組(C組),G組置于隨機定位儀中暴露處理3 d,C組置于儀器邊上;由于CS果蠅為雙活動模型的晨昏性昆蟲[39],在開燈和熄燈時會出現活動高峰[40],本研究于6∶00 pm即熄燈時進行取樣;每管10只雄蠅,放入EP管中,液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用.利用TRIzol法提取待測樣品的總RNA,利用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度,根據PrimeScript?RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒的步驟和反應條件將RNA反轉錄成cDNA,所得cDNA用超純水稀釋15倍后作為RT-PCR的模板,根據SYBR?Premix Ex Taq?II(Tli RNaseH Plus)的步驟和反應條件進行相對定量檢測,RT-PCR的擴增程序中TM值為55℃,40個循環.RT-PCR反應均以rp49作為內參基因,結果采用2-△△Ct方法進行計算分析[41].以上實驗重復3次以上.檢測所用引物序列見表1.

  Table 1 Primer sequences   
Table 1 Primer sequences

  1.5、 神經遞質相關基因表達水平及含量的檢測

  本研究進一步檢測了模擬微重力效應對多巴脫羧酶、酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的編碼基因ddc、pale和trh的表達情況.其中基因表達水平的檢測方法與生物鐘基因檢測方法一樣(詳見1.4),檢測所用引物序列見表1.

  此外,進一步檢測模擬微重力效應對多巴胺(dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)兩種神經遞質含量的影響,具體方法如下:取新生雄蠅裝入試管中,設置處理組(G組)以及對照組(C組),G組置于隨機定位儀中暴露處理3 d,C組置于儀器邊上.于6∶00 pm即熄燈時進行取樣,每管25只雄蠅,放入EP管中,液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用,利用上海酶聯的昆蟲多巴胺試劑盒以及昆蟲5-羥色胺試劑盒測定雄蠅體內DA和5-HT兩種神經遞質的含量.

  1.6 、數據統計及分析

  本研究的數據采用Microsoft Excel和SPSS 25軟件進行統計分析.組間差異采用獨立樣本t檢驗分析.統計結果均用Mean±SEM表示,“*”表示P<0.05,對照組(C組)和處理組(G組)之間的差異達到顯著水平;“**”表示P<0.01,對照組(C組)和處理組(G組)之間的差異達到極顯著水平.

  2 、結果

  2.1 、模擬微重力效應對運動及睡眠行為的影響

  2.1.1 、短時間模擬微重力效應的影響

  選取處理前靜置1 d、處理3 d及處理結束后1 d共5 d連續監測的數據進行雄蠅運動情況的統計分析.雄蠅的運動變化規律表明,C組和G組的雄蠅均表現出一定的晝夜變化規律,在6∶00 am和6∶00 pm左右各有一個運動高峰期(圖2a),與果蠅自身的晝夜節律以及實驗所設置的光照周期相同,主要受光周期變化的影響,但處理期間振幅有所差異.通過分析模擬微重力效應處理3 d時間內雄蠅的運動情況.結果顯示:G組雄蠅24 h總運動次數(P<0.01)和單位時間運動次數(P<0.05)均增加;獨立分析白天和夜晚的運動情況顯示,G組雄蠅白天總運動次數和單位時間運動次數與C組相比雖然略有增加,但均未達顯著水平,而夜晚的總運動次數和單位時間運動次數均增加(P<0.01)(圖2b、c).模擬微重力效應增強了雄蠅夜晚的運動量和單位時間運動量.

  Fig.2 Effects of simulated microgravity on the activity of Drosophila melanogaster
Fig.2 Effects of simulated microgravity on the activity of Drosophila melanogaster

  (a)Activity rhythm,grey bars stand for nighttime,green bars stand for the time of simulated microgravity.(b)Activity counts in different periods.(c)Activity counts per minute in different periods.White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01.

  進一步分析雄蠅的睡眠情況,結果顯示:C組和G組的雄蠅睡眠均表現出一定的晝夜變化規律,在6∶00 am和6∶00 pm左右各有一個睡眠低谷期(圖3a),與果蠅的運動變化規律剛好相反,可能主要與外界光周期的變化相關,但在振幅方面表現出了差異.同樣分析統計了模擬微重力效應處理3 d時間內雄蠅的睡眠情況,結果顯示:G組雄蠅24 h總睡眠時間減少(P<0.01)、睡眠次數減少(P<0.01)、每次睡眠長度增加(P<0.05);獨立分析白天和夜晚的睡眠情況顯示,G組雄蠅白天睡眠的時間雖然與C組的差異未達顯著水平,但其睡眠次數減少(P<0.01)、每次睡眠長度增加(P<0.01),顯示雄蠅長時睡眠增多,睡眠質量較高;夜晚睡眠時間減少(P<0.01),睡眠次數減少(P<0.01),但每段睡眠長度與C組的差異未達顯著水平(圖3b、c、d).結果顯示:雄蠅總睡眠時間的減少主要是由于夜晚睡眠次數減少,導致睡眠時間的減少造成的.因此,短時間模擬微重力效應下雄蠅夜晚的睡眠次數減少、睡眠時間縮短、單位時間運動次數增加、運動量增加.

  Fig.3 Effects of simulated microgravity on the sleep of Drosophila melanogaster
Fig.3 Effects of simulated microgravity on the sleep of Drosophila melanogaster

  (a)Sleep rhythm,grey bars stand for nighttime,green bars stand for the time of simulated microgravity.(b)Sleep time in different periods.(c)Sleep episode number in different periods.(d)Length of sleep episode in different periods.White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01

  2.1.2、 長時間模擬微重力效應的影響

  在短時間模擬微重力效應對雄蠅運動及睡眠的影響研究中,設備關閉后,雄蠅的運動和睡眠行為很快恢復到對照的水平.因此,本研究進一步分析較長時間模擬微重力效應對雄蠅運動及睡眠的影響,分別在處理10 d、20 d及30 d后,隨機取部分C組和G組的雄蠅,在對照條件下進行連續3 d的行為監測.雄蠅的運動變化規律表明,不管是處理10 d、20 d還是30 d,C組和G組的雄蠅均表現出一定的晝夜變化規律,在6∶00 am和6∶00 pm左右各有一個運動高峰期(圖4a),這與短時間處理一致,主要受光周期的影響.進一步分析雄蠅運動情況顯示:處理10 d后雖然雄蠅24 h總運動次數與C組的差異未達顯著水平,但是其白天的運動量增加(P<0.05),夜晚單位時間運動次數減少(P<0.05);處理20 d后運動情況與C組的差異未達顯著水平;處理30 d后夜晚的運動次數(P<0.05)和單位時間運動次數(P<0.01)均減少,白天的與C組的差異未達顯著水平(圖4b、c).

  Fig.4 Effects of different duration of simulated microgravity on the activity of Drosophila melanogaster
Fig.4 Effects of different duration of simulated microgravity on the activity of Drosophila melanogaster

  (a)Activity rhythm after experiment,grey bars stand for nighttime.(b)Activity counts in different periods after experiment.(c)Activity counts per minute in different periods after experiment.White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01.

  睡眠的分析結果顯示:睡眠變化規律同樣不受暴露時間的影響,呈現出一定的晝夜變化規律,在6∶00 am和6∶00 pm左右各有一個睡眠低谷期(圖5a),與短時間處理一致,主要受光周期的影響.進一步分析睡眠情況,結果顯示:處理10 d后雄蠅白天的睡眠時間減少(P<0.05);處理20 d和30 d后各睡眠參數與C組的差異均未達顯著水平(圖5b、c、d).

  2.2 、生物鐘相關基因的表達水平

  果蠅的睡眠-覺醒狀態與生物鐘調控密切相關,本研究選取模擬微重力效應暴露處理3 d的雄蠅,進一步檢測了核心生物鐘基因per、tim、clk、cyc和cry的表達水平,結果顯示:per基因的相對表達水平與C組的差異未達顯著水平,tim、clk、cyc和cry的相對表達水平均增加(P<0.01),其中clk基因約為C組的2.5倍(圖6)[42].

  Fig.5 Effects of different duration of simulated microgravity on the sleep of Drosophila melanogaster
Fig.5 Effects of different duration of simulated microgravity on the sleep of Drosophila melanogaster

  (a)Sleep rhythm after experiment,grey bars stand for nighttime.(b)Sleep time in different periods after experiment.(c)Sleep episode number in different periods after experiment.(d)Length of sleep episode in different periods after experiment.White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01.

  Fig.6 Effect of simulated microgravity on the relative mRNA level of selected circadian clock genes of Drosophila melanogaster
Fig.6 Effect of simulated microgravity on the relative mRNA level of selected circadian clock genes of Drosophila melanogaster

  White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01.

  2.3、 神經遞質相關基因的表達水平及含量

  果蠅的睡眠-覺醒狀態也受到神經系統的調節,本研究檢測模擬微重力效應對DA和5-HT合成中多巴脫羧酶的編碼基因ddc、DA合成中酪氨酸羥化酶的編碼基因pale和5-HT合成中色氨酸羥化酶的編碼基因trh表達水平的影響,結果顯示:ddc、pale和trh基因的相對表達水平均增加(分別為P<0.01,P<0.01,P<0.05)(圖7a).進一步檢測了雄蠅體內DA和5-HT的含量,結果顯示模擬微重力效應處理下雄蠅DA和5-HT的含量與C組的差異均未達顯著水平(圖7b、c).

  Fig.7 Effects of simulated microgravity on the selected neurotransmitter of Drosophila melanogaster
Fig.7 Effects of simulated microgravity on the selected neurotransmitter of Drosophila melanogaster

  (a)Relative mRNA level.(b)Content of DA.(c)Content of 5-HT.White and black boxes represent data of control and simulated microgravity flies,respectively.*P<0.05,**P<0.01.

  3 、討論

  隨著我國航天員或航天工程師未來在軌工作時間的延長,如何保障航天員在軌期間的高質量睡眠乃至在軌健康穩態的維護已經成為影響我航天事業長遠發展亟待解決的重要關鍵問題之一.而目前關于空間環境對睡眠的影響及作用機制了解甚少.我們研究了利用自研的隨機定位儀開展模擬微重力效應對果蠅睡眠行為研究的可行性,并初步探討模擬微重力效應對果蠅運動及睡眠的影響.

  短時間模擬微重力效應處理結果表明,雄蠅運動和睡眠節律的變化與培養環境中光周期的變化一致.一方面,可能是模擬微重力效應對運動和睡眠節律沒有影響;另一方面,考慮到光是強授時因子,模擬微重力效應的影響可能較微弱,以至于在一定程度上其影響會被光周期所掩蓋[31].該結果也從側面說明隨機定位儀自身的轉動并不會影響果蠅的固有節律.從短時間的模擬微重力效應處理下雄蠅運動和睡眠的分析結果可以看出:模擬微重力效應增強了夜晚雄蠅的運動能力,這主要反映在雄蠅夜晚睡眠時間和睡眠次數的減少;白天平均每段睡眠時長增加,可能與雄蠅夜晚的運動增加且睡眠時間減少而產生的睡眠補償機制相關[43,44,45,46];白天及夜晚的睡眠次數都減少,可能表明雄蠅在實驗處理下更難入睡,尤其是夜晚.Nike-Orion探空火箭上搭載的果蠅在微重力飛行期間,也觀察到了其運動測量值大幅增加的情況[32];另外,在IML-2國際太空任務中,微重力暴露期間,果蠅的運動增加[47],在拋物線飛行中也有相似的發現[48],與本研究的結果一致.前述航天員的飛行報告和檢測結果[4]也表明,航天員在軌期間睡眠時間減少、睡眠質量變差,這與本研究中雄蠅睡眠時間減少的結果一致.在本研究中,雄蠅睡眠時間的減少主要是睡眠次數減少導致的,且主要影響的是夜晚睡眠.

  長時間模擬微重力效應處理結果表明,處理30 d后,雄蠅夜晚的運動減弱,推測與肌肉損傷[49,50,51,52]或者加快衰老[20,47,53]等相關,如IML-2國際太空任務中,在為期14.5 d的航天飛行之后,雄蠅在取下恢復后表現出加速老化反應[47].我們也對模擬微重力效應下雄蠅的壽命進行了研究,并沒有發現有顯著影響(附錄S1中圖S2),考慮到空間環境的復雜性,其他因素是否會造成協同作用,使得航天飛機暴露的變化更為明顯,還需進一步研究.除此以外,對雄蠅運動和睡眠的總體影響較小,這主要有兩方面原因.一方面,隨著處理時間的延長,雄蠅出現了適應性,Nike-Orion探空火箭上搭載的果蠅對微重力有瞬態響應的現象,運動水平在微重力的第2 min達到頂峰,之后便略有下降,但其微重力時長只有3.8 min,無法得出長時的影響[32],且有研究表明,在三次拋物線飛行中,年輕果蠅在第一次的0 g階段運動增加,但后兩次該效應減弱[48],而長時間飛行的航天員睡眠情況的調查結果也發現同樣的情況,部分航天員在飛行過程中的前30 d睡眠時間顯著減少,而后期會有一定的好轉[54].另一方面,由于長時間處理后,雄蠅是放置于對照環境中進行監測,因此該結果也與模擬微重力效應解除后雄蠅恢復相關,從短時間的處理中也發現了相似的情況,即設備關閉后,雄蠅的運動和睡眠都恢復到與對照無異.因此,我們認為生物體對微重力有很強的適應能力,且產生的部分危害是可恢復的,從航天員回到地面后的睡眠情況研究也發現類似的情況[4].

  為了進一步分析模擬微重力效應影響果蠅睡眠的機制,本研究從果蠅睡眠調控的生物鐘和神經遞質進行分析.生物鐘調控機制在物種間高度保守[55,56,57,58],依賴于轉錄-翻譯的負反饋回路機制,clk和cyc轉錄翻譯后形成的異二聚體蛋白CLK-CYC促進per和tim基因的表達,而per和tim轉錄翻譯后形成異二聚體蛋白PER-TIM反過來抑制CLK-CYC[33,57,59,60,61],且CLK可作為自身的抑制劑[62,63].而這種節律的起始點或相位可以被光照暴露重新設置,功能蛋白為cry編碼的CRY,其作為光受體,與TIM發生光依賴性結合,使PER不穩定,從而減少對CLK-CYC的抑制[64].本研究發現,短時間的模擬微重力效應處理后tim、clk、cyc和cry基因的相對表達水平均增加,這說明生物鐘能夠對模擬微重力效應做出響應.但有報道對在軌飛行后回收的果蠅進行轉錄組分析,發現核心生物鐘(per、tim和cry)并沒有明顯變化[31],這可能與其實驗是在飛行結束48 h后進行的相關,由本研究前述結果可見果蠅有很強的恢復能力,因此微重力對果蠅的影響可能已經恢復.而在神經系統方面,本研究對短時間處理后的神經遞質相關編碼基因的表達水平,以及神經遞質含量進行了測定,選擇了神經遞質DA和5-HT,DA能夠促進覺醒,而5-HT根據受體亞型的不同促進覺醒或睡眠[65,66,67,68].結果表明模擬微重力效應處理后,ddc、pale和trh的相對表達水平均增加,說明模擬微重力效應可能增強了相關神經遞質的合成,但是進一步的檢測結果卻表明DA和5-TH的含量并沒有出現變化,這可能與本研究檢測方式相關.本研究檢測了雄蠅整體的DA和5-TH含量,而對睡眠調控主要是腦部分泌至細胞外的神經遞質,而生物體總的神經遞質含量則相對穩定.同時,神經系統的調節并非是靠單一的神經遞質或激素,而是整個神經系統復雜的共同作用[65].

  雖然隨機定位儀并不能提供真正的微重力環境,但從果蠅運動和睡眠節律及相關參數的變化情況,我們認為利用隨機定位儀模擬微重力效應暴露處理下,在靜置階段,果蠅處理組和對照組的運動曲線和睡眠曲線高度重合,而在微重力效應模擬階段,果蠅仍然表現出其固有的節律行為.通過肉眼觀察也發現在設備轉動過程中,果蠅活動自如,并無諸如甩動、翻轉、飛行等行為出現(附錄S1中圖S1).同時,我們也對雄蠅氧化應激相關酶活性和基因進行了檢測,也未發現有顯著影響(附錄S1中圖S4、S5).本研究發現,模擬微重力效應下,短時間內雄蠅夜晚的運動能力增強且睡眠減少,但白天會出現睡眠補償,而隨著模擬微重力效應的解除或延長,這些影響都能得到恢復,這些與果蠅生物鐘和神經遞質的調控相關,但相關機制待進一步研究.

  因此,本研究認為利用模擬微重力效應研究微重力對果蠅運動及睡眠的影響具有一定的可行性,相關研究結果能夠為航天醫學研究,尤其是航天環境對航天員睡眠的影響研究提供一定的參考依據需要注意的是,利用隨機定位儀模擬微重力效應確實存在一定的不足,特別是在行為研究方面應用極少,我們希望做一些嘗試性研究,同時也在積極探索更好的方法,并努力開展一些在軌的測試,通過天-地對比實驗的檢驗,能夠更好地驗證地基實驗的相關結果,為評價該方法的可行性和科學性提供更多的參考依據.

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