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神經系統中Tau蛋白的常規分析方法綜述

時間:2020-04-01 來源:分析化學 作者:李淋雨,王曉英 本文字數:13684字

  摘    要: Tau蛋白(簡稱Tau),是一種參與神經系統發育的微管相關蛋白。其可經歷構象改變、異常mRNA剪接等,從微管解離,經系列翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM),自身形成病理性聚集,進而造成神經退行性病變,最終形成Tau病。研究Tau的病理過程,分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化,對Tau病的早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義。本文對目前國內外Tau的常規分析方法進行了概述和比較,重點闡述光學、電化學生物傳感方法的最新研究進展與相關應用,對未來發展方向進行了展望,為Tau蛋白的深入研究與應用提供參考。

  關鍵詞: Tau蛋白; Tau病; 生物傳感器; 翻譯后修飾; 評述;

  Abstract: Tau protein, simply referred to as Tau, is a type of microtubule-associated protein involved in the development of the nervous system. After experiencing conformational changes, abnormal mRNA splicing, etc. Tau dissociates from microtubules and undergoes a series of post-translational modification (PTM) to form pathological aggregation, which induces neurodegenerative diseases and tauopathies eventually. Numerous clinical studies suggest that studying the pathological process of Tau protein, analyzing and evaluating its PTM and quantitative detection of concentration changes are of great significance for the early diagnosis, tracking, prevention and treatment of tauopathies. In this paper, the conventional methods of Tau protein at home and abroad were summarized and compared. Specifically, the related applications and latest research progress of optical and electrochemical biosensors were mainly described. Furthermore, the summary of its future directions and the potential applications were proposed, which provided reference for the further research and application.

  Keyword: Tau protein; Tauopathies; Biosensor; Post-translational modification; Review;

  1 、引 言

  Tau蛋白(簡稱Tau),是一種參與神經系統發育的微管相關蛋白,其富集于神經元軸突周圍,與微管蛋白結合形成微管,可穩定微管并促進軸突運輸[1]。Tau經歷構象改變、異常mRNA剪接等,從微管解離,經系列翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM),自身形成病理性聚集,進而造成神經退行性病變,最終形成Tau病[2,3]。在進行性核上性麻痹、皮質基底節變性、額顳癡呆等原發性Tau病,C型Niemann-Pick病、阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)等繼發性Tau病中均可檢測到Tau的異常修飾、含量變化及病理沉積[4,5]。其中,由Tau異常聚集形成的神經元纖維纏結(Neurofibrillary tangle, NFT)是AD的病理標志之一[6]。研究Tau的病理過程,分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化,對Tau病的早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義。目前,已有少量關于Tau的神經成像技術的評述與報道。如Villemagne[7]等研究了示蹤劑的選擇,Hall等[8]研究了Tau與認知障礙的相關性,Hammes等[9]研究了Tau在神經退行性疾病中的病理性聚集。但并沒有全面反映近年來針對Tau的病理過程、分析檢測方法的最新研究進展。基于Tau結構的特殊性、PTM與聚集過程的復雜性等,對Tau的分析方法的靈敏度、高效性提出了更高的要求。本文對Tau的常規分析方法進行了概述和比較,重點闡述光學、電化學生物傳感方法的最新研究進展與應用,對其未來發展方向進行了展望。

  2 、Tau的結構與形態

  2.1、 結構

  Tau由位于17染色體長臂的基因編碼,含16個外顯子,長352~441個氨基酸,分子量為45~65 kDa。Tau可分為N末端投射功能區(N端)、脯氨酸富集區、微管結合區(Microtubule -binding domain, MBD)和C末端功能區(C端)。其中,N端長度不確定,可插入由外顯子2(E2)、3(E3)控制的額外片段。脯氨酸富集區含大量磷酸化位點,而C端提供了部分磷酸化位點[10,11]。重復序列(R1-R4)位于MBD,其微管結合力最強并促進微管自聚集[12,13],同時亦是雙螺旋細絲(Paired helical filament, PHF)的核心結構。人類Tau因mRNA剪輯方式不同,表達出6種同工異構體,即Tau352、381、383、410、412和441,其差異在于C端是否存在3或4個重復序列,N端是否存在有1或2個插入物[12]。外顯子10(E10)編碼R2片段,能保留E10且具有四個重復序列的Tau統稱為4RTau;不保留E10且只有3個重復序列的Tau統稱為3RTau[14]。成年人腦內3RTau、4RTau表達量相當,而成年老鼠只表達4RTau[15]。
 

神經系統中Tau蛋白的常規分析方法綜述
 

  2.2 、形態

  Tau單體結構類似“回形針”,如圖1A。其可經歷構象改變、異常mRNA剪接等,脫離微管致微管解聚并從惰性單體轉變為可聚集的“種子”形式(病理性Tau)。病理性Tau經C端-MBD,N端-C端相互作用,折疊形成Tau的低聚物[16],如圖1B。病理性Tau以朊病毒樣形式沿突觸在神經元間傳播,形成的低聚物經系列PTM后進一步在神經元中聚集形成PHF[17],如圖1C。

  圖 1 (A)Tau單體[16]; (B)Tau低聚物[16]; (C)病理性Tau的傳播過程[17]
圖 1 (A)Tau單體[16]; (B)Tau低聚物[16]; (C)病理性Tau的傳播過程[17]

  3、 Tau的PTM

  Tau 的PTM種類包括磷酸化(Phosphorylation)、糖基化(Glycation)、硝化(Nitration)、泛素化(Ubiquitination)、乙酰化(Acetylation)、甲基化(Methylation)和脯氨酰異構化(Prolyl-isomerization)等[18]。PTM可影響Tau的活性、結構及與其它蛋白質的相互作用。其中,磷酸化作為關鍵致病步驟受到廣泛關注[19]。

  3.1、 磷酸化

  磷酸化是在蛋白激酶(Protein kinases, PK)作用下將ATP的磷酸基團轉移到Tau氨基酸殘基上,形成磷酸化Tau(P-Tau)的過程。PK包括脯氨酸定向PK、非脯氨酸定向PK和酪氨酸蛋白PK [20,21]。去磷酸化是經蛋白磷酸酶(Protein phosphatase, PP)去除P-Tau氨基酸殘基上的磷酸基團的過程,PP主要包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP3和PP5[22]。其中,PP2A的去磷酸化效應最強,在AD患者腦中的表達和活性均降低[23]。岡田酸(OA)可使PP1、PP2A失活引起氧化應激損傷,進而誘導P-Tau[24]。Tau含85個磷酸化位點,其中包括45個絲氨酸(Ser)、35個蘇氨酸(Thr)和5個酪氨酸(Tyr)殘基。部分磷酸化位點也可發生去磷酸化,但其發生反應所需PK、PP的種類與數量不同[25,26]。

  健康神經元中,磷酸化與去磷酸化保持動態平衡。當PP、PK調控失衡,磷酸化水平提高至正常的2~3倍,即引起過度磷酸化[27],可使Tau失去生物活性而不可溶、抗降解且易聚集,喪失穩定微管的正常功能并干擾和分解細胞骨架,最終影響軸突運輸機制并促成突觸功能障礙和神經變性[28,29]。此外,β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)、異常糖基化的誘導也可促成過度磷酸化[30,31]。

  3.2 、其它PTM

  糖基化經非酶促反應在氨基酸上修飾糖基,可使Tau降解受阻而發生聚集 [32]。硝化經硝基(-NO2)共價修飾Tyr殘基[33],抑制Tau結合與穩定微管的能力,使其更易聚集[34]。人體外硝化位點包括Tyr18、Tyr29、Tyr197和Tyr394,但Tyr29和Tyr197硝化更易引起Tau聚集[35]。泛素化是在系列酶的作用下將泛素修飾在C端MBD的賴氨酸(Lys)殘基上,其隨著PHF的增加而增加[36]。在AD患者PHF、腦脊液(Cerebrospinal fluid, CSF)中,泛素化Tau含量較高[37]。

  乙酰化是經組蛋白乙酰轉移酶在Lys殘基修飾乙酰基,其可調節細胞功能和能量代謝并誘導P-Tau[38]。甲基化是通過在Lys和精氨酸殘基上引入甲基,可影響Tau與微管結合及Tau同工異構體間的相互作用[39]。甲基化位點多分布于MBD,可促進磷酸化并與乙酰化、泛素化等存在競爭作用[40]。脯氨酰異構化于Thr231重排二硫鍵,使Tau從順式構象轉變為反式構象[41]。反式構象的Tau不與微管結合,經聚集形成PHF[42];肽基-脯氨酰順/反異構酶可使其轉變為順式構象,恢復與微管結合力并促進PP2A去磷酸化[43]。

  目前,磷酸化作為調控AD的關鍵步驟而受到廣泛關注。正常情況下,磷酸化和去磷酸化分別負、正調控Tau與微管的親和力,且二者保持動態平衡[44]。病理情況下,Tau因過度磷酸化形成P-Tau,其與微管結合力減小而脫離微管,致微管解聚、神經元發生變性和死亡,最終誘導AD[45];同時,易自我聚集的P-Tau在某些PTM影響下,經歷形態改變、發生聚集并最終形成NFT[20],上述兩種途徑同時發生則進一步加快了AD的病理進程(圖2)。

  圖 2 Tau引起AD的病理進程  
圖 2 Tau引起AD的病理進程

  4、 Tau的常規分析方法

  Tau的常規分析方法主要包括神經成像、免疫檢測和質譜(Mass spectrometry, MS)技術。其中,神經成像技術可用于研究Tau的病理成像,免疫檢測方法用于血漿或CSF中Tau或P-Tau的分析,質譜技術則主要用于研究Tau的PTM。

  4.1 、神經成像

  神經成像泛指能夠直接或間接對腦部的功能、結構和藥理學特性進行成像的技術,可捕捉腦部Tau的形態改變,利于臨床研究和診斷,包括正電子發射斷層掃描(Positron emission computed tomography, PET)、單光子發射計算機化斷層顯像(Single-photon emission computed tomography, SPECT)和磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)等。PET經放射性示蹤劑標記抗體,對細胞表面抗原進行掃描顯像,為無創方法[46]。Tau與示蹤劑標記的抗體特異性結合后,經PET顯示分布情況,示蹤劑保留的形貌與預期病理階段對應,且Tau的沉積模式與代謝減退之間存在密切關系[47]。目前,18F-AV-T807和18F-AV-1451是Tau常用的示蹤劑[48,49],但因示蹤劑的半衰期較短(18F:110min),使PET檢測Tau的應用受限[50]。

  SPECT是以單光子放射性核素標記藥物作為顯像劑,通過掃描病人體內放射性標記藥物發射的γ射線的成像技術。苯基二芐基苯并噻唑(PDB)是常用藥物,小鼠的生物分布實驗表明,PDB衍生物在大腦中呈持續放射性水平,目前尚不適合用于人體NFT成像[51]。

  MRI經體外高頻磁場對靜磁場中的人體施加某特定頻率的射頻脈沖,激發人體內水和脂肪的氫質子而引起磁共振現象,并通過獲得的電磁信號重建人體信息。多參數MRI、高分辨率結構MRI等對評估Tau病理改變意義重大[52,53]。

  4.2 、免疫檢測方法

  免疫檢測基于抗原-抗體的特異性結合,包括酶聯免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、蛋白質印跡法(Western blot, WB)、基于納米粒子的免疫聚合酶鏈式反應(Nanoparticles-immuno polymerase chain reaction, Nano-iPCR)和免疫磁減量(Immunomagnetic reduction, IMR)等。

  ELISA是目前應用最廣泛的方法之一。Arai等[54]采用ELISA證明AD患者的CSF-Tau((95.6±105.3)pg/mL) 顯著高于正常人((32.7±43.2)pg/mL),靈敏度為93.8%,特異性為75%,提示可經CSF-Tau預測AD。Kohnken等[55]利用夾心ELISA測定AD患者CSF-P-Tau的截斷值為10.1 ng/ml,靈敏度為85%,特異性為97%,總體準確度為91%。與CSF-Tau相比,CSF-P-Tau因與AD進程高度相關更受關注。

  WB又稱免疫印跡,是將蛋白質經凝膠電泳分離后,通過抗原-抗體的特異性結合完成檢測。其操作簡單,可直接對抗體進行熒光標記,廣泛用于定量檢測Tau和P-Tau [56]。R?thlisberger等[57]采用WB獲得AD患者唾液中P-Tau和總Tau的比值(P-Tau/T-Tau),與正常人相比(0.96),75%的AD患者P-Tau/T-Tau可升高至1.00,該法靈敏度為73%,特異性為50%。唾液與血漿、CSF相比,因無創、易得等優點廣受關注。但因敏感性和特異性不足,尚無法直接用于臨床測試。

  Nano-iPCR是經納米粒子放大信號,結合免疫PCR檢測的技術。Stegurová [58]等采用Nano-iPCR定量檢測Tau,經PCR板孔內的抗體捕獲Tau形成抗原-抗體復合物后,結合金納米粒子(AuNPs)標記的二抗,形成雙抗夾心復合物,經免疫PCR檢測。Tau的檢出限(Limit of detection, LOD)為5 pg/mL,線性范圍為10-10000 pg/mL,回收率為89%~113%,明顯優于ELISA的分析性能(LOD,140 pg/mL;線性范圍,75-600 pg/mL)。

  IMR是通過測量靶蛋白與磁性納米顆粒(Magnetic Nanoparticles, MNPs)結合導致檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低的百分比來測定靶分子。Chiu等[59]應用標記MNPs的抗體捕獲Tau,隨著Tau含量增高,分散的MNPs形成團簇,使檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低,基于IMR信號值的變化定量檢測Tau。結果顯示,早期AD組血漿的Tau為(53.9±11.7)pg/mL,明顯高于健康老年組((15.6±6.9)pg/mL)和輕度認知障礙組((33.2±5.4)pg/mL),提示經測量血漿Tau可預測AD。

  4.3、 質譜技術

  MS技術具有靈敏度高、樣品用量少、可同時進行分離和鑒定等優勢,多用于研究Tau的PTM。Min等[60]采用MS技術研究了Tau的乙酰化,證實其直接導致P-Tau積累并調節PP和PK活性;干擾乙酰化,可直接影響磷酸化進程。Thomas等[61]分析了Tau的甲基化和泛素化,證實甲基化Lys分布于N端和MBD,在Lys254位點與泛素化競爭底物,與乙酰化、磷酸化等PTM共同調節Tau的功能。研究表明,小鼠和人的Tau序列具有高度相似性,如小鼠Tau430的序列與人類Tau441相比,有89%相同、92%相似[15]。Morris等[62]經研究野生型小鼠和人淀粉樣前體蛋白小鼠內源性Tau430的PTM,證實兩種類型小鼠的Tau430具有類似的PTM,同一Lys位點存在乙酰化、泛素化和甲基化的競爭;發生磷酸化的位點多在MBD附近,且因MBD存在高密度的帶正電荷Lys殘基,更易發生乙酰化和甲基化。目前,MS被廣泛應用于研究Tau的PTM,但其維護成本高、操作復雜。

  目前,Tau的常規分析方法在安全性、靈敏度及檢測成本等方面仍存在一定的不足,開發更加高效、經濟、快速、準確的分析方法對Tau病的預防、干預和治療具有重要意義。

  5 、生物傳感方法

  目前,應用于Tau分析檢測研究的生物傳感方法主要包括光學和電化學生物傳感方法。

  5.1 、光學生物傳感方法

  基于輸出的特征光學信號,檢測Tau的光學生物傳感方法包括表面等離子共振(Surface plasmon resonance, SPR)、局部表面等離子共振(Localized surface plasmon resonance, LSPR)、熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和表面增強拉曼散射(Surface-enhanced raman scattering, SERS)等。

  SPR是金屬介質表面的自由電子吸收入射光的能量后發生共振的現象。在目標分子結合金屬介質表面吸附的生物分子后,引起折射率發生改變,進而造成共振光譜的移動,可據此實現對目標分子的定量檢測 [63]。Lisi等[64]基于SPR平臺,采用抗體捕獲Tau,設計了直接檢測(A)、無標記三明治夾心(B)及標記三明治夾心(C)三種模式定量檢測Tau,如圖3所示。檢測Tau的線性范圍分別為7~250、2~25和125~1000 nmol/L,LOD分別為15、2和0.125 nmol/L。

  圖 3基于表面等離子體共振技術檢測Tau的三種模式:(A)直接檢測;(B)無標記三明治夾心法;(C)標記三明治夾心法
圖 3基于表面等離子體共振技術檢測Tau的三種模式:(A)直接檢測;(B)無標記三明治夾心法;(C)標記三明治夾心法

  適配體是經指數富集的配體系統進化(SELEX)技術篩選得到的人工合成的單鏈核酸序列,可直接與靶分子(金屬離子、蛋白質、細胞和微生物等)結合,與抗體相比,其批次間差異小、穩定性和特異性更佳[65]。Kim等基于SPR平臺聯用抗體-適配體檢測Tau381 [66]及同時檢測Tau381與α-1抗胰蛋白酶(Antitrypsin, AAT)[67]。如圖4A和4B所示,在SPR傳感片表面固定適配體,捕獲靶標物并結合抗體,形成類三明治復合物。該法檢測Tau381的LOD為10 fmol/L,線性范圍為2~80 pmol/L,并用于同時檢測人血漿樣品AAT和Tau,顯示了臨床應用的潛能。

  圖 4 基于抗體和適配體聯用的SPR平臺檢測Tau[66] (A)和同時檢測AAT、Tau[67] (B)的示意圖  
圖 4 基于抗體和適配體聯用的SPR平臺檢測Tau[66] (A)和同時檢測AAT、Tau[67] (B)的示意圖

  LSPR是電介質包圍的金屬納米結構中的自由電子在局部表面發生共振產生的光學現象,受金屬納米顆粒的種類、形狀以及大小的變化影響 [68]。Vestergaard等[69]基于多點定位的LSPR芯片檢測Tau,LSPR芯片經活化、固定Tau抗體并進一步捕獲Tau后,引起LSPR芯片表面厚度的增加,通過測定吸光度的變化實現測定。該法可檢測低至10 pg/mL的CSF-Tau,低于臨床區分AD患者與正常人的CSF-Tau的臨界值(195 pg/mL)。Kim等[70]基于LSPR平臺,利用不同類型的AuNPs偶聯抗體,同時完成多靶標的準確分離和鑒定。球形AuNPs (直徑50 nm)、長寬比分別為1.6、3.6的短棒、長棒狀AuNPs偶聯抗體后,分別用于捕獲Tau、Aβ1-40和Aβ1-42,然后采用光譜儀檢測。結果顯示,Tau、Aβ1-40和Aβ1-42的LOD分別為23.6、34.9、26 fmol/L,可在10~108 fmol/L的濃度范圍對AD生物標志物進行同時快速檢測。因血漿中存在多種AD生物標志物(Tau、Aβ1-40、Aβ1-42)干擾Tau的檢測,Kim等[71]聯用長寬比為3.67的長棒桿AuNPs和鹽酸胍,提高靶向Tau的能力。鹽酸胍可破壞Tau與其它蛋白質分子間氫鍵、減弱疏水作用而減少其折疊和聚集,從而提高對Tau的捕獲量,該方法檢測Tau的LOD為1.56 pmol/L,線性范圍103~108 fmol/L。測定人血漿中Tau的含量的相對標準偏差(Relative standard deviation, RSD)為1.98%~3.60%,回收率為94.43%~102.27%。

  SERS與納米金屬材料聯用可增強拉曼信號并提高信噪比[72]。Zengin等[73]利用MNPs復合物固定的抗體捕獲Tau,與AuNPs標記的二抗結合、形成三明治復合物后定量檢測Tau,如圖5A所示。該法無需純化即可快速檢測Tau,LOD低至25 fmol/L,線性范圍25 fmol/L~500 nmol/L。

  FRET是基于兩個分別作為能量供體與能量受體的熒光基團距離處于1.0~10.0 nm之間時,供體的能量向受體轉移而引起的現象[74]。Kjaergaard等[75]利用FRET研究了Tau的聚集,如圖5B所示,分別用FRET供體和受體標記等量Tau。Tau發生聚集時,供體和受體標記的Tau距離縮小,發生FRET,產生熒光響應信號。該方法測定Tau低聚物的LOD為4.25 nmol/L,線性范圍37~104 nmol/L。

  圖 5 (A) 基于SERS平臺聯用MNPs和AuNPs檢測Tau的示意圖 [73]; (B)基于FRET平臺檢測Tau[75]  
圖 5 (A) 基于SERS平臺聯用MNPs和AuNPs檢測Tau的示意圖 [73]; (B)基于FRET平臺檢測Tau[75]

  因光學傳感具有靈敏度高、成本低、穩定性好和抗電磁干擾能力強等優點,針對Tau的光學傳感研究具有巨大發展潛能。

  5.2、 電化學生物傳感方法

  電化學生物傳感方法[76]具有響應速度快、成本低、靈敏度高和易于微型化等特點,受到廣泛關注。目前Tau的電化學生物傳感研究包括病理學監測和定量檢測,常用的電化學檢測技術包括循環伏安法(Cyclic voltammetry, CV)、電化學阻抗譜(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)、方波伏安法(Square wave voltammetry, SWV)和差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)等。

  5.2.1 、Tau的病理學監測

  (1)針對P-Tau的研究

  目前僅有少數對P-Tau的電化學研究報道,尚無直接檢測P-Tau的報道。如Martic等[77]研究了5'-γ-二茂鐵基三磷酸腺苷(Fc-ATP)與糖原合成激酶3-β(GSK-3β)、PKA、肉瘤相關激酶(Src)對P-Tau的催化作用,測定了其最大反應速度(Vmax)和在1/2Vmax的底物濃度(KM)。在金電極表面固定Tau,在Fc-ATP與PK的作用下發生磷酸化。Fc-ATP中負電荷的γ-磷酸基從ATP轉移到Ser、Thr或Tyr殘基引起電流密度改變,可用于檢測Fc-ATP濃度,線性范圍為5-200 μmol/L,LOD為2 μmol/L。濃度依賴性實驗結果顯示,GSK-3β、Src和PKA的KM值分別為(11±0.5)、(7±0.5)和(13±0.5)μmol/L,Vmax為 ((0.010-0.025)±0.005)μA/(cm2min)。因不同PK作用的磷酸化位點存在差異,Rains等[78]進一步監測了Fc-ATP與多種PK(Gsk-3β、Src、Abl、Fyn和TTBK等)對P-Tau的催化作用,結果顯示,多種PK聯用后對P-Tau的催化作用大于單一PK,且PK的種類和磷酸化順序對Tau膜的電化學特性影響不同。

  Jahnke等[79]基于人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和微電極測量平臺研究了P-Tau。在環狀培養容器固定細胞后,施加交流電壓并記錄Rct,結果顯示,SH-SY5Y經OA處理后,在10h內Rct降至28%±19%,提示OA具有誘導P-Tau的作用;在OA處理前,將SH-SY5Y與Tau激酶抑制劑SRN預孵育1小時后,在前8h內Rct無顯著變化,10h后降低至24%±7%,表明SRN對OA誘導P-Tau的阻礙作用。

  (2)  Tau-蛋白質相互作用

  為了監測Tau之間的相互作用,分析其早期錯誤折疊,Esteves等[80]采用EIS監測固定于Au電極上的Tau在Tau溶液中孵育前后的電化學阻抗信號變化。Tau-Tau相互作用時,帶正電的Tau與檢測液中的氧化還原探針Fe(CN)63- / 4-發生靜電作用,使電荷轉移電阻(Rct)從(2.9±0.6)kΩ降到(0.3±0.61)kΩ,Tau溶液濃度在0.2~1.0 μ mol/L時與Rct變化值呈線性關系,其濃度低至0.2 μ mol/L時,仍可觀察到Tau-Tau相互作用。

  (3)Tau-金屬離子相互作用

  大腦中高濃度的金屬離子使Tau金屬化,因此廣受關注。在Cu2+與非磷酸化的Tau(n-Tau)和P-Tau相互作用的研究中[81],將n-Tau和P-Tau分別置于不同pH、濃度的含Cu2+溶液中孵育,經CV檢測,結果顯示,在中性pH(7.4)時,n-Tau和P-Tau與Cu2+的結合程度相似;pH過高或過低時,通過影響P-Tau結構而阻礙其結合Cu2+。此外,Cu2+和Zn2+可競爭性結合P-Tau,P-Tau與Zn2+優先結合形成絡合物后,阻礙Cu2+與P-Tau結合。

  Ahmadi等[82]研究了Tau、P-Tau與Fe2+、Fe3+的相互作用。在金電極表面固定Tau,分別置于含Fe2+和Fe3+的溶液中孵育。與Tau-Fe3+相比,在Tau-Fe2+中檢測到明顯降低的Rct和增大的電流密度,提示Fe2+更易結合Tau。經圓二色光譜測量Tau的二級結構(α螺旋,225nm)變化的峰強度,在Fe2+中該峰強度在前3小時內穩定增長,在24小時后恢復到225nm;在Fe3+中該峰強度緩慢增強,在24小時后仍未恢復到225nm,證實Fe2+、Fe3+可引起Tau構象改變,但Fe2+對Tau構象的影響是迅速、可逆的,Fe3+對Tau構象的影響是緩慢、不可逆的。經DPV測量P-Tau與Fe2+、Fe3+在不同PK作用下電流強度的變化顯示,Tyr位點顯著影響P-Tau、Fe2+相互作用,而Ser、Thr位點顯著影響P-Tau與Fe3+相互作用。

  5.2.2、 Tau的定量檢測

  目前,電化學定量檢測Tau的研究報道較少。Derkus等[83]構建了雙抗夾心型電化學生物傳感器同時檢測髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein, MBP)和Tau。絲網印刷碳電極經氧化石墨烯和聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾后,固定MBP和Tau的抗體,二抗分別綴合CdS和PbS,經DPV和EIS檢測Cd2+和Pb2+的電化學信號。MBP和Tau的LOD分別為0.30 nmol/L和0.15 nmol/l,線性范圍分別為0.50 nmol/L ~500 nmol/L和0.25~250 nmol/L。檢測人工CSF中MBP、Tau的回收率分別為96.3%~111.1%和99.1%~111.1%,顯示該傳感器具有較好的臨床應用潛能。

  Wang等[84]構建了含四個金微帶電極的電化學生物傳感器檢測Tau,如圖6A所示,包括一個工作電極(WE)、一個對電極(CE)和兩個參比電極(RE)。工作電極表面修飾自組裝單層膜并固定Tau抗體,Tau-抗體特異性結合引起電化學信號變化,實現Tau的檢測,方法的LOD為10-14 mol/L,線性范圍是10-14~10-7 mol/L,靈敏度明顯優于ELISA,可檢測人血清中低至0.03 pmol/L的Tau。

  結合適配體的高親和力與AuNPs可放大信號的優勢,Shui等[85]基于電化學生物傳感方法聯用抗體-適配體測定Tau,如圖6B所示,金電極上固定的抗體捕獲Tau后,與半胱胺、AuNPs和適配體結合形成復合物,進一步放大電化學信號。檢測Tau的LOD為0.42 pmol/L,線性范圍為0.5~100 pmol/L,人血清樣本中Tau的回收率為97.1%~102.0%,RSD為4.8%~5.75%,顯示其對復雜實際樣品良好的檢測效果。

  圖 6 (A) 四電極電化學生物傳感器的構成和檢測Tau工作原理[84]; (B) 聯用抗體-適配體的三明治夾心型電化學生物傳感器測定Tau的示意圖[85]  
圖 6 (A) 四電極電化學生物傳感器的構成和檢測Tau工作原理[84]; (B) 聯用抗體-適配體的三明治夾心型電化學生物傳感器測定Tau的示意圖[85]

  6、 結論與展望

  本文介紹了Tau的結構與形態、主要的翻譯和修飾過程以及常規分析方法,闡述了通過光學、電化學生物傳感方法檢測Tau的與最新研究與應用進展。因Tau結構的特殊性、PTM與聚集過程的復雜性,提高研究方法的靈敏度、選擇性以及多樣性仍然是當前研究重點。未來的研究將集中于應用新型納米材料提高靈敏度、開發新型識別元件提高選擇性以及提高方法的實用性方面。因檢測Tau與P-Tau對Tau病早期診斷、跟蹤、預防和治療具有重要意義,拓展多樣性研究并進一步促進其實用性,將是未來研究的方向。

  TOC (Table of Contents):

  Tau蛋白是參與神經系統發育的微管相關蛋白,因構象改變、異常mRNA剪接、翻譯后修飾等導致Tau病。本文基于Tau的結構和形態,在介紹常規檢測方法的同時,重點關注光學、電化學生物傳感的研究現狀。

  Tau, as a microtubule-related protein involved in the development of the nervous system, causing taupathy after undergoing a series of changes. For example, conformational changes, abnormal mRNA splicing and a series of post-translational modifications. Based on the structure and morphology of Tau, the conventional detection methods of Tau are introduced in this review. Meanwhile, the research status based on optical biosensor and electrochemical biosensor are focused emphatically.

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